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行業(yè)新聞

熒光顯微鏡的物鏡種類介紹:從基礎(chǔ)設(shè)計到功能特性的全面解析

  • 作者:微儀管理員
  • 發(fā)布時間:2025-09-05
  • 點擊:63

熒光顯微鏡作為生命科學(xué)、材料科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的核心工具,其成像質(zhì)量與檢測靈敏度高度依賴物鏡的光學(xué)性能。物鏡作為顯微鏡的眼睛,不僅決定了放大倍數(shù)與分辨率,還需適配熒光激發(fā)/發(fā)射光譜的傳輸效率、抗熒光淬滅能力及樣品適應(yīng)性。本文將從基礎(chǔ)分類、功能特性及選型邏輯三個維度,系統(tǒng)梳理熒光顯微鏡物鏡的核心種類及其技術(shù)優(yōu)勢,為科研人員提供從理論到實踐的參考指南。

一、按校正方式分類:消除像差,提升成像精度

物鏡的光學(xué)設(shè)計需校正色差(Chromatic Aberration)與像場彎曲(Field Curvature),以實現(xiàn)高分辨率、均勻照明的熒光成像。根據(jù)校正程度的不同,物鏡可分為以下三類:

1. 消色差物鏡(Achromat Objective)

設(shè)計原理:
通過單層氟化鈣(CaF?)或特殊玻璃材料,校正紅色(~656 nm)與藍(lán)色(~486 nm)波長的軸向色差,但對綠色及其他波長的校正不足。

倒置熒光顯微鏡.png

熒光應(yīng)用場景:

單色熒光標(biāo)記樣本:如僅標(biāo)記DAPI(核染色,激發(fā)波長358 nm,發(fā)射波長461 nm)的細(xì)胞樣本,消色差物鏡可滿足基礎(chǔ)定位需求。

低預(yù)算實驗:適用于教學(xué)實驗室或初步篩選實驗,其成本較其他物鏡低30%~50%。

局限性:
在多色熒光共定位實驗中,不同顏色通道的焦點偏移(色差)可能導(dǎo)致圖像錯位,需通過軟件后期校正。

2. 復(fù)消色差物鏡(Apochromat Objective)

設(shè)計原理:
采用多層氟化物玻璃(如螢石)或超低色散材料,校正紅、綠、藍(lán)三色及近紫外/近紅外波長的軸向色差,同時部分校正橫向色差(Lateral Chromatic Aberration)。

熒光應(yīng)用場景:

多色熒光共定位實驗:如同時標(biāo)記GFP(綠色,488 nm激發(fā))、mCherry(紅色,587 nm激發(fā))的活細(xì)胞樣本,復(fù)消色差物鏡可確保兩色通道的焦點高度重合(焦點偏移<0.2 μm)。

超分辨率熒光成像:如STED(受激發(fā)射損耗顯微鏡)或PALM(光激活定位顯微鏡)技術(shù),需物鏡具備高數(shù)值孔徑(NA>1.4)與低色差,以支持亞衍射極限分辨率(<200 nm)。

技術(shù)優(yōu)勢:
復(fù)消色差物鏡的數(shù)值孔徑(NA)通常可達(dá)1.25~1.49,較消色差物鏡(NA=0.1~0.75)提升2~5倍,顯著提高光收集效率與分辨率。

3. 平場復(fù)消色差物鏡(Plan-Apochromat Objective)

設(shè)計原理:
在復(fù)消色差基礎(chǔ)上,通過非球面鏡片校正像場彎曲,使整個視場(如直徑22 mm的全畫幅)內(nèi)圖像亮度與分辨率均勻。

熒光應(yīng)用場景:

大視場熒光成像:如組織切片的多標(biāo)記免疫熒光染色(IHC),需同時觀察整個組織區(qū)域(如腫瘤微環(huán)境)內(nèi)多種蛋白的表達(dá)分布。

高通量篩選實驗:如384孔板或芯片上的細(xì)胞熒光信號檢測,平場設(shè)計可避免邊緣區(qū)域圖像變形導(dǎo)致的信號漏檢。

數(shù)據(jù)對比:
傳統(tǒng)復(fù)消色差物鏡的視場邊緣分辨率較中心下降約30%,而平場復(fù)消色差物鏡的邊緣分辨率損失可控制在5%以內(nèi)。

 

二、按數(shù)值孔徑(NA)分類:平衡分辨率與穿透深度

數(shù)值孔徑(NA=n·sinθ,n為物鏡與樣品間介質(zhì)的折射率,θ為物鏡對樣品的*大接收角)是決定物鏡分辨率與光收集能力的核心參數(shù)。根據(jù)NA值的不同,物鏡可分為以下兩類:

1. 低NA物鏡(NA<0.5)

設(shè)計特點:

工作距離長(通常>5 mm),適合觀察厚樣本(如活體組織、植物葉片)或需操作的空間(如微注射、電生理記錄)。

光收集效率低,需配合高亮度光源(如LED或激光)以補償熒光信號強(qiáng)度。

熒光應(yīng)用場景:

活體動物成像:如斑馬魚胚胎或果蠅幼蟲的全身熒光標(biāo)記觀察,低NA物鏡可避免因工作距離不足導(dǎo)致的樣本損傷。

透射光與熒光雙模成像:如結(jié)合明場或相差模式觀察細(xì)胞形態(tài),同時通過熒光標(biāo)記定位特定蛋白(如微管蛋白)。

2. 高NA物鏡(NA>0.7)

設(shè)計特點:

工作距離短(通常<0.5 mm),需使用蓋玻片(厚度0.17 mm)或?qū)S门囵B(yǎng)皿以縮短物鏡與樣品的距離。

光收集效率高,可檢測弱熒光信號(如單分子熒光或低表達(dá)蛋白的標(biāo)記)。

熒光應(yīng)用場景:

單分子熒光成像:如使用FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù)檢測蛋白質(zhì)相互作用,高NA物鏡(NA=1.49)可提升信號信噪比(SNR)至10:1以上。

共聚焦顯微鏡應(yīng)用:高NA物鏡是共聚焦掃描頭的核心組件,其點擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的半高寬(FWHM)更窄,可實現(xiàn)光學(xué)切片(厚度<0.5 μm)與三維重建。

 

三、按特殊功能分類:適配多樣化實驗需求

隨著熒光技術(shù)的拓展,物鏡設(shè)計逐漸融入抗熒光淬滅、長工作距離、多模態(tài)兼容等特性,以滿足特定場景的需求。

1. 長工作距離(LWD)物鏡

設(shè)計原理:
通過優(yōu)化鏡片曲率與材料折射率,延長物鏡前端到樣品焦平面的距離(通常>2 mm),同時保持高NA(如NA=0.6~0.8)。

熒光應(yīng)用場景:

活細(xì)胞動態(tài)觀察:如記錄神經(jīng)元突觸傳遞過程中鈣離子(Ca2?)的熒光變化,長工作距離物鏡可避免物鏡接觸培養(yǎng)液導(dǎo)致的細(xì)胞擾動。

微流控芯片成像:芯片通道高度通常為100~500 μm,傳統(tǒng)物鏡無法聚焦,而LWD物鏡可穿透通道并清晰成像內(nèi)部流體中的細(xì)胞或顆粒。

2. 水浸物鏡(Water Immersion Objective)

設(shè)計原理:
以水(n=1.33)作為物鏡與樣品間的介質(zhì),替代空氣(n=1.0)或油(n=1.518),減少光在介質(zhì)界面處的折射損失。

熒光應(yīng)用場景:

深組織成像:如小鼠大腦皮層的雙光子熒光成像,水浸物鏡可補償組織折射率(n≈1.38)與空氣的差異,減少像差并提升穿透深度(>500 μm)。

活體樣本長期觀察:水浸物鏡對樣品的機(jī)械壓力更小,適合長時間(>24小時)記錄胚胎發(fā)育或腫瘤生長過程。

3. 多模態(tài)兼容物鏡

設(shè)計原理:
通過優(yōu)化鏡片鍍膜與光路設(shè)計,支持熒光、明場、相差、DIC(微分干涉對比)等多種成像模式的無縫切換。

熒光應(yīng)用場景:

臨床病理診斷:如對腫瘤組織切片進(jìn)行H&E染色(明場)與免疫熒光標(biāo)記(如PD-L1)的雙模態(tài)觀察,多模態(tài)物鏡可避免反復(fù)更換物鏡導(dǎo)致的樣本位置偏移。

材料科學(xué)表征:如同時觀察金屬薄膜的表面形貌(DIC)與熒光標(biāo)記的缺陷位置(如氧化層分布),提升分析效率。

四、物鏡選型邏輯:從實驗?zāi)繕?biāo)到技術(shù)參數(shù)的匹配

科研人員需根據(jù)樣本類型、熒光標(biāo)記策略及成像需求,綜合選擇物鏡的校正方式、NA值與特殊功能:

單色熒光標(biāo)記樣本:優(yōu)先選擇消色差物鏡以降低成本,若需高分辨率可升級至復(fù)消色差物鏡。

多色熒光共定位實驗:B須使用復(fù)消色差或平場復(fù)消色差物鏡,確保色差校正充分。

厚樣本或活體觀察:選擇長工作距離物鏡或水浸物鏡,平衡分辨率與穿透深度。

弱熒光信號檢測:優(yōu)先高NA物鏡(NA>1.0)以提升光收集效率,必要時配合冷卻型CCD或sCMOS相機(jī)降低噪聲。


熒光顯微鏡物鏡的設(shè)計已從單一的光學(xué)校正向多功能、高適應(yīng)性方向演進(jìn)。無論是復(fù)消色差物鏡對多色熒光的**捕捉,還是水浸物鏡對深組織成像的突破,其核心目標(biāo)均為提升熒光信號的檢測靈敏度與成像真實性。未來,隨著超分辨技術(shù)(如SIM、STED)與活體成像需求的增長,物鏡將進(jìn)一步融合自適應(yīng)光學(xué)、智能鍍膜等技術(shù),為生命科學(xué)探索與臨床診斷提供更強(qiáng)大的視覺工具。

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